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乙肝想要治愈?绕不开它?HBV cccDNA 检测方式梳理_健

发布日期:2020-05-28 03:28   来源:未知   阅读:

很多战友知道 HBV cccDNA 的概念,在之前的科普文章中我们经常提到,因为清除cccDNA 是实现乙肝彻底治愈的终极目标,很多战友对 HBV cccDNA 的相关进展非常关注。

介于此,小编为大家梳理了 HBV cccDNA 在临床上目前常用的检测方案,以便大家有更加深入的了解。

cccDNA 在病毒周期中的作用

首先我们再来回顾一下 HBV cccDNA 在 HBV 生命周期中的作用。

HBV 感染肝细胞后, 病毒脱衣壳露出松弛环状 DNA(rcDNA)进入肝细胞核内修复完整双链并发生构象转变成超螺旋结构的 cccDNA. cccDNA 在肝细胞核内积聚, 形成 cccDNA 池。

然后以 cccDNA 作为模板, 转录出病毒的各种 RNA, 制造病毒蛋白, 完成 DNA 复制并组装形成新的子代病毒。

cccDNA检测方法

在实验室中,目前 cccDNA 检测公认较为准确的方法是Southern blot, 该方法的原理是基于核酸分子凝胶电泳迁移率差异 , 能够较好地区分 rcDNA(relaxed circular DNA)、线性dsDNA(double-stranded DNA)和 cccDNA 等不同形式的 HBV 核酸,其检测结果准确可靠, 但是分析灵敏度较低, 操作也比较复杂, 不适合于高通量的药物筛选和临床实践应用。

除了 Southern bot 外,已有多种基于核酸扩增的、灵敏度更高的方法被报道。

总体上,cccDNA 准确检测的核心问题是要避免其他形式的 HBV DNA (尤其是 rcDNA)的干扰。检测方法的选择很大程度上取决于待测样品中 cccDNA 的含量,临床上目前最为常见的检测 cccDNA 的方法是通过肝脏穿刺后采用选择性 qPCR 来检测 cccDNA 拷贝数。

除了常规的 PCR 方法以外,给各位战友介绍几种比较特殊的 PCR 方法。

一. 微滴-数字 PCR

微滴-数字 PCR(droplet-digital PCR, ddPCR)系统在近 10 年来迅速发展并开始用于 cccDNA 检测。

该方法通过将样本制备成数以万计的液滴, 每个液滴独立进行 PCR 反应。含有可探测荧光信号的目标序列的液滴被标记为阳性事件, 如果液滴反应中没有信号, 则记录阴性事件。

该分析结果包含了数千乃至上万个反应, 构成一个泊松分布, 随后计算阳性和 阴性微滴的数量, 从而以数字格式对 cccDNA 进行定量分析。

2018 年,Huang 等人采用 基于探针的 ddPCR 方法可以实现慢乙肝患者血清, 单细胞和组织样本中 cccDNA 的检测, 且灵敏度和特异性均有出色表现,大大提升了 cccDNA 的检测下限。

二. 滚环扩增 PCR

由于 cccDNA 在 HBV DNA 中所占的比例很小, 血清中HBV cccDNA水平并不是敏感的病毒学指标。

福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肝活检组织用于常规病理检查, 比新鲜分离的肝活检组织更容易获得, 与新鲜或冷冻保存的肝活检组织相比, FFPE 标本在临床上更有应用价值, 并且有大量的存档资料可供研究。

Zhong 等人设计了滚环扩增(RCA)与实时 PCR 相结合的方法解决了这一问题。

该研究利用 Phi29DNA 聚合酶设计了 4 组针对多个结合位点的 RCA 引物,由于 phi29 DNA 聚合酶在 RCA 中选择性地扩增了环状模板分子, 这一步骤的加入显著提高了 HBV cccDNA 检测的敏感性, 获得了更高效的扩增效果, 并且将经典方法中忽略的整合 HBV DNA 的影响降到最低。

今天,我们关于cccDNA 的知识先介绍到这里。明天,将继续梳理剩下的cccDNA检测方法,敬请期待哟!